The Japanese Society for Clinical Microbiology
一般社団法人日本臨床微生物学会
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多剤耐性菌関連

多剤耐性菌検査の手引き

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IV.多剤耐性菌を判別するための各種検査法とその注意点

西神戸医療センター臨床検査技術部
山本  剛

1)ディスク法

 ディスク法は微量液体希釈法に比べランニングコスト安く、薬剤選択も容易に行える簡易的な薬剤感受性試験である。一定の測定条件に基づき寒天平板上に出来るディスク阻止円径を測定し感受性結果を判定する方法で、菌種や薬剤により異なるのが特徴である。テクニカル上、阻止円の測定は感受性培地の種類により反射光か透過光を選び、ノギスまたは定規により阻止円径を測定するためmm単位の測定技術が要求される。
 多剤耐性菌検出時は判定方法に誤りが無ければ、誘導耐性株やmutationを起こしている菌株に関して視覚的に判断可能な点もあり、MIC法に比べて判定が容易である。しかし、ESBLのスクリーニング規準のように従来使用している感受性の判定規準では耐性菌を見落とす可能性もあり、抗菌薬の感受性を見るのか、薬剤耐性菌のスクリーニングをするのか目的を明確に分けて検査する必要がある。その場合は、他の方法で耐性菌スクリーニング検査や確定検査を実施し、陽性反応を示した場合は、仮に感受性と判定された抗菌薬でも、薬剤耐性機序を考慮して判定結果を耐性と変換する。

1)ESBL(基質拡張型β-ラクタマーゼ)産生菌
 ESBLは本来、ペニシリンより基質拡張した抗菌薬として開発されたβ-ラクタム薬(主に第3世代セフェム)をも加水分解するβ-ラクタマーゼの事を指し、今日、CLSIではEscherichia coliKlebsiella pneumoniaeKlebsiella oxytocaProteus mirabilisの4菌種について規準が決められている。しかし、実際はESBLsを産生する細菌は上記の4つの菌種以外にも腸内細菌群をはじめとするグラム陰性桿菌に多く存在するのが特徴である1)。現在は、前述の4つの菌種に対してのみ判定が可能であり、それ以外の菌種で同じクライテリアが適応出来るかどうかは検討されていない。

  1. ESBLスクリーニング法
     ESBLsの特徴は、Cefpodoxime(CPDX)、Ceftadizime(CAZ)やCefotaxime(CTX)のような第3世代セフェムに耐性を示すため、ESBL単独の薬剤耐性機序を持ち合わせている場合は、第3世代セフェムに耐性を示した腸内細菌群でカルバペネムやセファマイシン感受性となった菌については注意を払うことが必要になってくる2)
     前述した3剤でスクリーニングする場合は以下に示す。CPDX(10μg/ml)、CAZ(30μg/ml)、CTX(30μg/ml)含有のディスクを使用し、通常の薬剤感受性方法と同じく感受性検査を行い判定する。E. coliK. pneumoniaeK. oxytocaであればCPDX≦17mm、CAZ≦22mm、CTX≦27mm、P. mirabilisであればCPDX≦22mm、CAZ≦22mm、CTX≦27mmとなればESBLを疑い確認検査を実施する(図1)。
  2. ESBL確認検査
     CLSIはスクリーニング検査陽性となった菌株は以下の方法でESBLの確認検査を行うことになっている。CAZ(30μg/ml)とCAZ(30μg/ml)にクラブラン酸(CVA)を10μg/mlを加えたディスク、またはCTX(30μg/ml)とCTX(30μg/ml)にクラブラン酸(CVA)を10μg/mlを加えたディスクを通常の薬剤感受性検査方法と同様に検査し、CVA含有ディスクの方が5mm以上阻止円径の拡張を認めた場合に陽性とする。この時、注意する点はAmpCを同時に保有している菌株に関しては規定の5mm以上の拡大が観察されることが無い可能性があることである。
     この方法とは違うがCVAとセファロスポリンとの間で緩衝帯を確認する方法としてダブルディスクシナジーテスト(DDST)法がある。通常の感受性方法と同じ培養条件で培養するが、培地の中心にAMPC/CVAのディスクを設置し、ディスクの中心より25mmの間隔をあけてセファロスポリンのディスクを設置し、ディスク間に出来た緩衝帯を確認する方法である。緩衝帯が出来ればCVAによる阻害反応が見られたことが分かり、ESBLsと確認出来る方法である(図2)。

2)AmpC型β-ラクタマーゼ産生菌
 CLSIの基準は無い。
 腸内細菌群のうち、Enterobacter spp.、Serratia spp.、Citrobacter spp.の3菌種は元々染色体性にAmpCを有している。そのため、AmpCの産生量を増強(過剰産生)させる抗菌薬を使用するとAmpCの産生量が増え(誘導耐性型)、第3世代セフェムにも耐性化しやすい。また、前述した3つの菌種は、臨床の検出頻度も高く、薬剤選択の中における薬剤感受性の意義は高い3)4)
 AmpC型β-ラクタマーゼの過剰産生菌はESBL産生菌と同じく、カルバペネムは感受性であるが、第3世代セフェム(CPDX、CTX、CAZなど)が耐性になる腸内細菌群であるのが特徴である。AmpC産生菌のうちでESBLsを同時に保有する場合は、ディスク法も含めて表現形での鑑別が難しく、Cefepime(CFPM)やCefpirome(CRP)のような第4世代セフェムを用いてのスクリーニング検査が必要になってくる。
 プラスミド性AmpCはセファマイシンも分解出来る能力を持ちMOX型やFOX型、CMY型β-ラクタマーゼの報告がある。一部カルバペネムに対して耐性傾向のことが報告されているので、今後カルバペネマーゼとの鑑別が必要になる。染色体性が報告されているEnterobacter spp.、Serratia spp.、Citrobacter spp.の場合はAmpCの証明をする臨床的意義が低いが、Klebsiella spp.のように元々、AmpCの産生が無い菌種でセフェム耐性が認められた場合は、プラスミド性のAmpCを疑いボロン酸添加による阻止帯の確認5)やホッジ試験により酵素産生をスクリーングすることも必要になるかもしれない6)

3)MBL(メタロβ-ラクタマーゼ)産生菌
 CLSI M02-A10やM07-A8にはわずかながら解説がなされているものの、明確な検出基準は示されていない。
 MBLは酵素の中心活性に金属イオン(主にZn2+)を有するβ-ラクタマーゼで、カルバペネムを含めたβ-ラクタムの殆どに耐性となるのが特徴的である。日本ではPseudomonas aeruginosaSerratia marscecensでの分離例は多くあったが、Enterobacter cloacaeCitrobacter freundiiからの分離例も報告されている7)。腸内細菌群での拡がりは「我が国における新たな多剤耐性菌の実態調査」の報告8)によるとIMP-1で72株、NDM-1が2株検出されていた。NDM-1型の国内伝播は現在も確認されていない。IMP-1は、E. coliKlebsiella pneumoniaeのような頻回に検出される腸内細菌群での検出例が多く、IMP-1が既に国内で蔓延化している可能性が示唆される。
 MBLは、腸内細菌群の薬剤感受性でカルバペネムを測定することで検出は可能である。しかし、一部の菌株では、カルバペネムに感受性があり見落としてしまう場合も想定されるため、IMP型やVIM型が蔓延化している日本においてはカルバペネムに加えてCAZの感受性も同時に測定しておくと良い。CAZはカルバペネムよりMBLの検出感度が高いことが報告されている9)
 カルバペネムおよびCAZ耐性となった場合、SMAや2-メルカプトプロピオン酸(2-MPA)、EDTAによるMBLスクリーニング検査9)やHodge変法試験を行う。KPCはAmblerの分類でClassAのため、中心活性がセリンになるので通常EDTAで阻害が見られない。MBLとKPCとの鑑別にはボロン酸による阻害試験もある10)11)図3)。
 NDM-1については既にCTX-M15やCMY-4のように他のβ-ラクタマーゼが混合していることがあるので12)、CAZを用いたSMA(2-MPA)法では検出が難しい例もあり、CAZに加えてMEPMによるスクリーニング試験を推奨する(図4)。

4)KPC型β-ラクタマーゼ産生菌
 CLSIでは腸内細菌を対象としたスクリーニング試験について記載がある。カルバペネマーゼ全般に対する解釈であるが、KPC型β-ラクタマーゼの検出を主眼に置いた方法である。CLSIには2010年のM100-S20よりカルバペネマーゼの確定検査として変法ホッジ試験も記載されている。
 KPC型β-ラクタマーゼはカルバペネマーゼであるが、MBLと異なりAmblerの分類ではClassAになる。そのため、SMA(2-MPA)や、EDTAによる阻害反応が見られないのが特徴である。KPC型β-ラクタマーゼの中で、ディスク法で実施した場合カルバペネムに感受性になるもの、カルバペネムの種類により検出感度が悪いものも存在する13)

  1. カルバペネマーゼのスクリーニング
     スクリーニング法は通常の感受性検査と同様にertapenem(10μg/ml)かmeropenem(MEPM)(10μg/ml)含有のディスクで判定する。imipenem(IPM)カルバペネマーゼのスクリーニングとしては感度が悪く推奨出来ない。また、ertapenemは日本で採用されていないディスクであり、実際検査にはMEPMを使用することになる。スクリーニングの結果MEPMは16-21mmの阻止円径が得られればカルバペネマーゼの存在を疑う。この時、腸内細菌科の判定規準を用いると、MEPMが16mm以上が感受性と判定されるため注意して判定しなければならない。
  2. カルバペネマーゼの確認検査
     カルバペネマーゼのスクリーニング陽性の場合、変法ホッジ試験によりKPC型β-ラクタマーゼを含めたカルバペネマーゼの有無を決定する。変法ホッジ試験は、予め予備培養したE. coliのATCC25922をMacFarland0.5に希釈し、その10倍希釈液を原液としてMHA一面に塗布する。3-10分間後、MHA表面が濡れていないのを確認、MHAの中心にMEPMディスクを設置する。次にMEPMディスクの縁より被検菌と陽性対照(カルバペネマーゼ産生菌、例K. pneumoniae BAA-1705など)、陰性対照を培地の外側に向けて、それぞれ1本ずつ白金線画線する。翌日、阻止円と画線した菌と交差する点でクローバ状の阻止円の歪みが見られた場合は陽性と判定する。この時、MBL産生腸内細菌群も変法ホッジ試験は陽性となるため変法ホッジ試験のみでは完全に判定出来ない場合がある。その場合はAmpCの検出時に用いるボロン酸による阻害確認検査を実施することでMBLとの鑑別が可能である。MEPMの阻止円径に比べてMEPMにボロン酸を加えたディスクの方が阻止円径の拡張(5mm以上)の有無を調べることで鑑別可能である11)図5図6図7図8)。

5)OXA型β-ラクタマーゼ産生菌
 CLSI法を含めて効率の良い検査方法について記載されているものが少ない。
 OXA型β-ラクタマーゼはAcinetobacter baumaniiでの検出例が問題視されている。OXA型の特徴はSMAや2-MPA、EDTA、ボロン酸の阻害を受けず表現型では明確に鑑別出来ない点である。そのため、A. baumaniiのような菌種に絞り、MBLとKPCなどAmblerの分類でClassAとClassBに属しないカルバペネマーゼと同定されればPCR検査で最終的な同定をする必要がある。A. baumaniiは元々OXA-51というβ-ラクタマーゼを保有している12)。しかし、感作されない場合はその遺伝子発現は無いが、発現させるプロモーターを取り込むことで酵素発現をすることが分かっている。OXA-51型の他にはOXA-23型、OXA-24型とOXA-58型の各クラスターが地域流行を起こし、プラスミド伝達による耐性化が示唆されている12)図9図10図11)。

参考文献

  1. D. L. Paterson,R. A. Bonomo.2005.Extended-Spectrum β-Lactamases: a Clinical Update, Clinical Microbiology Reviews, Oct., p. 657–686.
  2. CLSI,Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing;Twentieth Informational Supplement, M100-S20,Jan.2010.
  3. G. A. Jacoby.2009. AmpC β-Lactamases, Clinical Microbiology Reviews, Jan., p. 161–182.
  4. W. E. Sanders, JR., C. C. Sanders.1997. Enterobacter spp.:Pathogens Poised To Flourish at the Turn of the Century, Clinical Microbiology Reviews,Apr. p. 220–241.
  5. T. Yagi, J. Wachino,et.al.2005.Practical Methods Using Boronic Acid Compounds for Identification of Class C β-Lactamase-Producing Klebsiella pneumoniae and Escherichia coli, Journal of Clinical Microbiology, June, p. 2551–2558.
  6. P. E. Coudron, E. S. Moland, K. S. Thomson,2000.Occurrence and Detection of AmpC Beta-Lactamases among Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, and Proteus mirabilis Isolates at a Veterans Medical Center,JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY,May ,p. 1791–1796.
  7. Hisaaki Nishio, Masaru Komatsu,et.al.2004.Metallo-β-Lactamase-Producing Gram-Negative Bacilli:Laboratory-Based Surveillance in Cooperation with 13Clinical Laboratories in the Kinki Region of Japan, JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, Nov. ,p. 5256–5263.
  8. 厚生労働省結核感染症課:「我が国における新たな多剤耐性菌の実態調査」の結果について,平成23年1月24日, http://www.mhlw.go.jp/bunya/kenkou/kekkaku-kansenshou19/cyousa_kekka_110121.html
  9. Y. Arakawa,N. Shibata,et.al.2000, Convenient Test for Screening Metallo-β-Lactamase-Producing Gram-Negative Bacteria by Using Thiol Compounds, Journal of Clinical Microbiology,Jan. , p. 40–43
  10. A. Tsakris, I. Kristo: First occurrence of KPC-2-possessing Klebsiella pneumoniae in a Greek hospital and recommendation for detection with boronic acid disc tests, Journal of Antimicrobial Chemotherapy.doi:10.1093/jac/dkn364.
  11. Y.Doi, B. A. Potoskist,al.2008.Simple Disk-Based Method for Detection of Klebsiella pneumoniae Carbapenemase-Type β-Lactamase by Use of a Boronic Acid CompoundSimple Disk-Based Method for Detection of Klebsiella pneumoniae Carbapenemase-Type -Lactamase by Use of a Boronic Acid Compound,JCM, Dec. ,p. 4083–4086.
  12. K. K. Kumarasamy, M. A. Toleman,et.al.Emergence of a new antibiotic resistance mechanism in India, Pakistan, and the UK: a molecular, biological, and epidemiological study,Lancet infectious disease, Published online August 11, 2010 DOI:10.1016/S1473-3099(10)70143-2.
  13. K. F. Anderson,D. R. Lonsway,et.,al.2007.Evaluation of Methods To Identify the Klebsiella pneumoniae Carbapenemase in Enterobacteriaceae, Journal of Clinical Microbiology, Aug. , p. 2723–2725.
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